Evaluation of macrocyclic lactone resistance in gastrointestinal nematodes of first season grazing cattle

Löpmagsmasken Ostertagia ostertagi och tunntarmsmasken Cooperia oncophora är parasitära nematoder som orsakar skador i mag-tarmkanalen framför allt hos unga nötkreatur och förekommer över hela världen. Skadorna leder till nedsatt tillväxt hos värddjuret och därigenom ekonomisk förlust för djurägaren. Vid kraftigare infektioner kan de även orsaka klinisk sjukdom och utgöra ett djurskyddsproblem. Förebyggande åtgärder tillämpas i viss utsträckning i det svenska lantbruket men avmaskning med anthelmintika utgör alltjämt hörnstenen i en effektiv parasitkontroll bland förstagångsbetande nötkreatur på konventionella gårdar. Under det senaste decenniet har resistens mot avmaskningsmedel bland nötkreaturens parasiter påvisats i en allt högre grad världen över, i synnerhet på södra halvklotet där läkemedlen traditionellt använts i hög utsträckning. Undersökningar från USA och Europa, främst Storbritannien och Belgien, har pekat på att problemet finns även på norra halvklotet och bör påverka hur vi tänker kring antiparasitär behandling av boskap. Denna avhandling baseras på fem publikationer och syftar till att utreda resistensläget bland svenska nötkreatur samt undersöka möjliga mekanismer bakom anthelmintikaresistens. Ett tvåårigt fältförsök genomfördes genom ett internationellt samarbete, där Tyskland, Sverige och Belgien deltog under betessäsongerna år 2006 och 2007. Fem svenska gårdar valdes ut och 10-15 förstagångsbetare avmaskades efter inledande träckprovtagning och följdes sedan upp med nya prover efter 7 och 21 dagar. Träckproverna undersöktes med avseende på förekomst av maskägg och art av mask. Resultaten av våra mätningar bland svenska besättningar pekade mot förekomst av anthelmintikaresistens, då vi såg en otillfredsställande effekt av avmaskningsmedlet ivermektin. Främst överlevde maskar av arten C. oncophora men också O. ostertagi. Försöket följdes upp med en fältstudie inkluderande svenska nötbesättningar av både mjölk- och köttras under somrarna 2009 och 2010. Initialt mättes nivåerna av parasitsmitta bland 107 respektive 64 besättningar via inskickade träckprover och ca 40 % av de anmälda betesgrupperna hade ett sådant parasittryck att de inkluderades i ett avmaskningsförsök. Mjölkrasbesättningarna och köttrasbesättningarna hade lika stor parasitbörda. I försöket fick djurägarna själva samla prover och sedan behandla djuren efter tydliga instruktioner och enligt gällande doseringsrekommendationer. Avmaskningsmedlen som förskrevs efter träckprovtagning och analys var s.k. pour-on preparat av typen makrocykliska laktoner. En till två veckor efter behandling provtogs djuren igen och nivåer av kvarvarande parasitsmitta mättes. Resultaten visade än en gång att avmaskningsmedlen gav en otillfredsställande effekt, då färre än 40 % av besättningarna uppnådde en acceptabel reduktion av maskägg i träcken. Molekylärbiologiska analyser av framkläckta larver visade vilken art som överlevt behandlingen, och även denna gång dominerade C. oncophora. Löpmagsmasken, O. ostertagi, kunde dock påvisas efter behandling i 15 % av besättningarna. Effekten av avmaskningsmedlet ivermektin utreddes vidare genom ett kontrollerat försök på universitetets forskningsanläggning, där kalvar infekterades med larver av både löpmagsmask och tunntarmsmask från två av de svenska gårdarna som deltog i fältförsöket 2006 och 2007. Maskägg samlades genom träckprovtagning under tre veckors tid för att senare analyseras med hjälp av laborativa och molekylärdiagnostiska metoder, innan djuren avmaskades. Denna gång visade sig avmaskningsmedlet ge acceptabel effekt enligt globala riktlinjer för detektion av anthelmintikaresistens. Fortfarande kunde dock en liten mängd överlevande maskar av båda arterna påvisas och åter igen var tunntarmsmasken, C. oncophora, mest motståndskraftig. Resultaten från fältförsöken skiljde sig alltså från de kontrollerade försöken med experimentellt infekterade djur. Detta pekar mot att flera faktorer än behandling och dosering skulle kunna påverka resultatet av läkemedlet. För att undersöka eventuella sådana faktorer, utfördes ytterligare ett kontrollerat försök på forskningsanläggningen, där ivermektinets effekt studerades under interaktion med glukokortikoiden dexametason. Båda läkemedlen gavs samtidigt till en av djurgrupperna och blodprovsanalys från dessa kalvar visade att plasmanivåerna av ivermektin sänktes betydligt under påverkan av kortisonet, jämfört med kontrollgruppens. Detta påverkade även avmaskningsresultatet, där kontrollgruppen hade en signifikant högre reduktion av maskägg i träcken. Mekanismerna bakom nematodernas utveckling av resistens mot ivermektin är ännu inte fullt kartlagda men problemet tycks vara multifaktoriellt. En gemensam nämnare mellan ivermektin och dexametason är P-glykoproteiner, s.k. PGP. Proteinet fungerar som en membranpump med syfte att transportera in eller ut ämnen ur celler i kroppen. Båda de givna läkemedlen påverkar eller påverkas av PGP. För att närmare undersöka proteinets roll i effekten av ivemektin, studerade vi vuxna maskar som vi samlat in före respektive efter avmaskning i ett av de kontrollerade försöken. Överlevande hanliga maskar av arten C. oncophora tenderade att uttrycka genen för en sorts PGP, Con-pgp-9, i högre utsträckning än innan de utsatts för ivermektin. Dock kunde vi med vårt underlag inte säkerställa resultaten statistiskt och genetiska studier med metoden AFLP kunde inte påvisa någon skillnad i genetisk mångfald före respektive efter avmaskning. Resultaten av de olika studierna pekar åt olika håll och visar på hur komplex problematiken med resistens mot makrocykliska laktoner är. I samtliga studier överlevde ett varierande och mer eller mindre acceptabelt antal maskar behandlingen med avmaskningsmedel och C. oncophora var ständigt den dominanta arten. Vi kunde också se att den uteblivna behandlingseffekten i fält inte nödvändigtvis beror på genetisk resistens, då samma maskpopulation gav ett helt annat resultat i kontrollerade försök på stall. Vi kunde inte heller säkerställa en genetisk skillnad hos de maskar som överlevt en avmaskning jämfört med maskar som undersökts innan behandlingen, men vi anade en tendens mot ökat genuttryck av Con-pgp-9 hos överlevarna. Det finns fortfarande en uppsjö av ännu oprövade mekanismer bakom anthelmintikaresistens att utreda i framtida forskning.